Importanti studi, che vedono la Seconda Università di Napoli
come realtà all’avanguardia, confermano le potenzialità delle
cellule staminali nella chirurgia plastica e nella medicina
rigenerativa.
Le cellule costituiscono la struttura
portante di tutti gli organismi viventi
e ciascuna di esse può originare solo da
una cellula preesistente. La cellula
uovo fecondata è in grado di dare origine,
attraverso tappe proliferative e differenziative,
ad un organismo pluricellulare
con miliardi di cellule.
Successivamente alla nascita e per
tutto l’arco della vita, alcune cellule si
rigenerano continuamente e rapidamente;
altre, invece, posseggono una
risposta rigenerativa molto ridotta.
Le cellule staminali (Stem Cells o SCs) sono cellule indifferenziate che hanno una straordinaria capacità autorigenerativa e, seguendo specifici pathways molecolari, possono dar vita a diversi tipi cellulari e diversi tessuti. La loro divisione detta “asimmetrica” genera una cellula uguale alla cellula madre (cellula staminale) e ad una cellula precursore di una progenie che darà origine, a sua volta, a cellule terminalmente differenziate (cellule mature), con strutture caratteristiche e funzioni specializzate.
In sintesi, una cellula staminale è definita da tre aspetti fondamentali:
• mantenimento della capacità di dividersi per un tempo indefinito;
• mantenimento dello stato di uncommitment;
• sensibilità a stimoli in grado di innescarne la replicazione ed indurla a differenziare in un particolare citotipo.
Alcuni autori classificano le cellule staminali sulla base della loro potenzialità differenziativa:
• Totipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo cellulare.
• Pluripotenti o multipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in alcuni tipi cellulari.
• Unipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in un solo tipo cellulare.
La cellula staminale totipotente è lo zigote (derivante dalla fusione di uno spermatozoo e di un’oocita) che è in grado di generare un intero organismo; le staminali pluripotenti possono dare origine a svariate tipologie cellulari, provenienti da foglietti germinativi differenti (mesoderma, endoderma ed ectoderma); le cellule multipotenti sono capaci di differenziarsi in diversi citotipi a partenza dallo stesso foglietto embrionale; infine le unipotenti sono cellule indirizzabili verso un solo citotipo.
Le cellule staminali possono essere classificate anche a seconda della loro provenienza:
• Cellule staminali embrionali o ESCs (Embrionic Stem Cells).
• Cellule staminali adulte o ASCs (Adult Stem Cells).
Le cellule che si sviluppano all’interno della massa cellulare interna sono cellule totipotenti dette ESCs (Embrional Stem Cells). Esse si caratterizzano per essere totipotenti, in quanto capaci di generare tutti i tipi cellulari e quindi tutti i tessuti. Per ottenere una coltura di ESCs è importante rimuovere microchirurgicamente la parte esterna della blastocisti, al fine di prelevare la restante parte interna, costituita in genere da poche decine di cellule. Da studi effettuati è stato dimostrato che le ESCs possono proliferare in vitro per lunghi periodi, rimanendo sostanzialmente indifferenziate.
Innestate in topi immunocompromessi, generano teratomi che contengono cellule differenziate provenienti dai tre foglietti embrionari. Non vi è alcun dubbio che le ESCs siano le più flessibili tra tutte le cellule staminali, ma il loro utilizzo presenta degli ostacoli, primo fra tutti le difficoltà tecniche di prelievo. Inoltre, l’attuale legislazione vigente in Italia ne vieta l’utilizzo. Una ASCs, così come tutte le cellule staminali, possiede due caratteristiche principali: generare cloni identici per lungo tempo e differenziare in cellule mature e specializzate. Solitamente le cellule staminali generano un citotipo intermedio prima di differenziarsi del tutto. Il citotipo intermedio viene detto precursore.
Le cellule progenitrici
nei tessuti fetali o nei tessuti maturi
sono cellule parzialmente differenziate
che danno vita a cellule specializzate,
definite “committed”.
Al contrario delle ESCs, di cui si
conosce la provenienza (Inner cell
mass), per le ASCs non si conosce
bene l’origine e non si sa molto circa la
loro definitiva caratterizzazione.
Si pensa che le ASCs blocchino il loro stato differenziativo durante il periodo fetale e si fermino in questo stadio fino a quando un segnale ben preciso non inneschi una cascata metabolica che porta alla replicazione ed alla loro successiva differenziazione.
Dare oggi una definizione accurata e precisa delle ASCs non è semplice. Innanzitutto una cellula staminale deve essere clonogenica, ovvero deve essere in grado di generare una linea perfettamente identica dal punto di vista genetico che deve essere in grado di differenziarsi nel citotipo del tessuto dove la stessa risiede.
La nuova cellula differenziata, quindi, avrà la stessa morfologia del tessuto di provenienza e sarà perfettamente integrata in esso.
La caratteristica principale di tutte le cellule staminali è la loro plasticità o capacità di transdifferenziare. Una cellula è in grado di differenziare in un citotipo di un tessuto diverso da quello di origine acquisendone tutte le caratteristiche proprie, dalla funzione alla morfologia, fino all’espressione degli antigeni. Le ASCs sono cellule pluripotenti con un elevato potere differenziativo. Esse posseggono la capacità di differenziarsi in molti citotipi, ma non hanno la capacità di generare un intero organismo, non essendo cellule totipotenti. Il tessuto adiposo è composto da adipociti maturi, fasci collagenici, hADASc (cellule staminali adiposo derivate), cellule derivanti dal sangue periferico, cellule vascolari e progenitori endoteliali. Gli adipociti maturi rappresentano circa il 90% della composizione dell’intero tessuto.
Nostri studi, pubblicati su riviste scientifiche internazionali, si sono concentrati sul caratterizzare ed isolare particolari popolazioni staminali presenti nel tessuto adiposo mediante saggi citofluorimetrici ed analisi differenziative. Le analisi sono state effettuate per specifici antigeni di staminalità quali CD34, CD90, CD117, CD105, CD44, CD54. Per valutare, invece, le potenzialità differenziative delle staminali presenti nel tessuto adiposo, si è proceduto alla stimolazione delle stesse in un terreno adipogenico, addizionato con insulina, indometacina ed isobutilmetilxantina.
Questi componenti sono in grado di accelerare notevolmente la conversione delle cellule mesenchimali indifferenziate in cellule adipose. Il differenziamento adipogenico che avveniva già pochi giorni dopo la stimolazione è stato confermato dalla presenza di cellule positive all’Oil Red O (un colorante specifico per i lipidi intracellulari), ma anche attraverso l’espressione di antigeni specifici, rappresentati, in questo caso, dal PPARg e dall’adiponectina esaminati attraverso uno studio di RT-PCR. Inoltre, le medesime cellule vanno anche incontro ad un incremento di antigeni espressi su cellule endoteliali, quali VEGF, CD44, CD54, CD31, CD133, Flk-1.
Lavorando sulle cellule del tessuto adiposo, i dati ottenuti dalle varie analisi da noi effettuate hanno avvalorato le nostre ipotesi, ossia che tali cellule fossero mesenchimali multipotenti, in grado cioè di espandersi facilmente in vitro e di differenziare in differenti citotipi, se esposte ad un ambiente che esse normalmente non incontrerebbero mai durante il loro percorso differenziativo. In questo modo le cellule rispondono ai segnali provenienti dal nuovo microambiente in cui si trovano, abbandonando il cammino differenziativo già intrapreso e vengono in qualche modo “riprogrammate”, così da differenziare verso un’altra linea cellulare.
Le cellule mesenchimali del tessuto adiposo risultano essere simili a quelle del midollo osseo stesso nel trattamento delle varie patologie dei tessuti e rappresentano pertanto una fonte importante per le terapie cellulari autologhe. Le strategie “rigenerative” basate sulla terapia cellulare come quelle che comprendono l’uso delle cellule staminali, sono di notevole importanza soprattutto perché, come nel nostro caso, la possibilità di ottenere un adipe differenziato impedisce la proliferazione incontrollata e l’aver ottenuto simultaneamente vasi sanguigni, impedisce la necrosi che è un effetto collaterale gravissimo che sinora ha fatto fallire tutti i tentativi di autoimpianto di adipe autologo e rappresentano l’ideale risorsa di cellule per la medicina rigenerativa.
La medicina rigenerativa utilizza le materie prime del corpo per la riparazione di cellule, matrice e/o componenti chimici per ripristinarne la naturale funzione. Le cellule staminali hanno richiamato l’attenzione soprattutto per la loro multipotenzialità e per la loro capacità a rigenerare (self-renewal); infatti le cellule staminali del midollo osseo, così come quelle del sangue periferico e del cordone ombelicale sono state utilizzate per una serie di patologie. Inoltre i problemi associati al trapianto allogenico come le risposte immunitarie dell’ospite ed il rigetto del trapianto, possono essere evitate grazie all’uso delle staminali autologhe. Quindi, le cellule staminali autologhe, come quelle derivate dal midollo osseo e dal tessuto adiposo, possono essere utilizzate clinicamente nella terapia “rigenerativa” e “ricostruttiva” se ottenute in quantità sufficienti.
Le cellule staminali in generale ed in particolare quelle adiposo derivate, costituiscono un reagente biologico di straordinaria importanza per la biomedicina e molteplici sono le aree della ricerca ove possono essere impiegate. Alcune tra le più promettenti sono quelle legate a: studio di proprietà farmacologiche di nuove molecole e tossicità di nuovi farmaci; organi artificiali (rene, fegato, cuore, denti, vasi); nuovi vettori utili per terapie geniche - per esempio le cellule staminali possono essere impiegate per il trasferimento di geni nelle terapie antitumorali o come “proiettili” contro particolari tipi di cellule cancerose; fattori responsabili per la attrazione delle staminali nel sito tissutale danneggiato ed ingegnerizzazione genetica al fine di evitare la reazione immunitaria.
Risultati dei nostri studi sono incoraggianti in quanto le staminali adiposo derivate rappresentano l’ideale risorsa di cellule per la medicina rigenerativa. In primo luogo, per la loro multipotenzialità ed in secondo luogo per avere una potenzialità significativa nell’angiogenesi e nella vasculogenesi, una delle limitazioni fondamentali della tecnica corrente di utilizzo del grasso autologo, con una netta ottimizzazione delle zone danneggiate da parte delle cellule staminali, successivo rilascio di fattori angiogenetici e formazione di nuovi vasi.
Questo processo favorirebbe lo sviluppo delle cellule staminali in adipociti maturi e in una nuova microcircolazione che andrebbe a sostituire il tessuto precedentemente danneggiato. Il nostro attuale obiettivo consiste nella ricerca di uno “scaffold”, cioè una impalcatura di sostegno per le cellule staminali da noi prodotte, utilizzando materiali riassorbibili come PLGA - poly (lactic-co-glycolic acid) - oppure l’utilizzo di spugne di acido ialuronico o matrici di collageno ovvero fibrina, per realizzare in laboratorio il tessuto nella sua interezza ed ampliarne le possibilità di impiego a fini ricostruttivi.
Le cellule staminali (Stem Cells o SCs) sono cellule indifferenziate che hanno una straordinaria capacità autorigenerativa e, seguendo specifici pathways molecolari, possono dar vita a diversi tipi cellulari e diversi tessuti. La loro divisione detta “asimmetrica” genera una cellula uguale alla cellula madre (cellula staminale) e ad una cellula precursore di una progenie che darà origine, a sua volta, a cellule terminalmente differenziate (cellule mature), con strutture caratteristiche e funzioni specializzate.
In sintesi, una cellula staminale è definita da tre aspetti fondamentali:
• mantenimento della capacità di dividersi per un tempo indefinito;
• mantenimento dello stato di uncommitment;
• sensibilità a stimoli in grado di innescarne la replicazione ed indurla a differenziare in un particolare citotipo.
Alcuni autori classificano le cellule staminali sulla base della loro potenzialità differenziativa:
• Totipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo cellulare.
• Pluripotenti o multipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in alcuni tipi cellulari.
• Unipotenti: generano un progenitore in grado di differenziarsi in un solo tipo cellulare.
La cellula staminale totipotente è lo zigote (derivante dalla fusione di uno spermatozoo e di un’oocita) che è in grado di generare un intero organismo; le staminali pluripotenti possono dare origine a svariate tipologie cellulari, provenienti da foglietti germinativi differenti (mesoderma, endoderma ed ectoderma); le cellule multipotenti sono capaci di differenziarsi in diversi citotipi a partenza dallo stesso foglietto embrionale; infine le unipotenti sono cellule indirizzabili verso un solo citotipo.
Le cellule staminali possono essere classificate anche a seconda della loro provenienza:
• Cellule staminali embrionali o ESCs (Embrionic Stem Cells).
• Cellule staminali adulte o ASCs (Adult Stem Cells).
Le cellule che si sviluppano all’interno della massa cellulare interna sono cellule totipotenti dette ESCs (Embrional Stem Cells). Esse si caratterizzano per essere totipotenti, in quanto capaci di generare tutti i tipi cellulari e quindi tutti i tessuti. Per ottenere una coltura di ESCs è importante rimuovere microchirurgicamente la parte esterna della blastocisti, al fine di prelevare la restante parte interna, costituita in genere da poche decine di cellule. Da studi effettuati è stato dimostrato che le ESCs possono proliferare in vitro per lunghi periodi, rimanendo sostanzialmente indifferenziate.
Innestate in topi immunocompromessi, generano teratomi che contengono cellule differenziate provenienti dai tre foglietti embrionari. Non vi è alcun dubbio che le ESCs siano le più flessibili tra tutte le cellule staminali, ma il loro utilizzo presenta degli ostacoli, primo fra tutti le difficoltà tecniche di prelievo. Inoltre, l’attuale legislazione vigente in Italia ne vieta l’utilizzo. Una ASCs, così come tutte le cellule staminali, possiede due caratteristiche principali: generare cloni identici per lungo tempo e differenziare in cellule mature e specializzate. Solitamente le cellule staminali generano un citotipo intermedio prima di differenziarsi del tutto. Il citotipo intermedio viene detto precursore.
Le cellule progenitrici
nei tessuti fetali o nei tessuti maturi
sono cellule parzialmente differenziate
che danno vita a cellule specializzate,
definite “committed”.
Al contrario delle ESCs, di cui si
conosce la provenienza (Inner cell
mass), per le ASCs non si conosce
bene l’origine e non si sa molto circa la
loro definitiva caratterizzazione. Si pensa che le ASCs blocchino il loro stato differenziativo durante il periodo fetale e si fermino in questo stadio fino a quando un segnale ben preciso non inneschi una cascata metabolica che porta alla replicazione ed alla loro successiva differenziazione.
Dare oggi una definizione accurata e precisa delle ASCs non è semplice. Innanzitutto una cellula staminale deve essere clonogenica, ovvero deve essere in grado di generare una linea perfettamente identica dal punto di vista genetico che deve essere in grado di differenziarsi nel citotipo del tessuto dove la stessa risiede.
La nuova cellula differenziata, quindi, avrà la stessa morfologia del tessuto di provenienza e sarà perfettamente integrata in esso.
La caratteristica principale di tutte le cellule staminali è la loro plasticità o capacità di transdifferenziare. Una cellula è in grado di differenziare in un citotipo di un tessuto diverso da quello di origine acquisendone tutte le caratteristiche proprie, dalla funzione alla morfologia, fino all’espressione degli antigeni. Le ASCs sono cellule pluripotenti con un elevato potere differenziativo. Esse posseggono la capacità di differenziarsi in molti citotipi, ma non hanno la capacità di generare un intero organismo, non essendo cellule totipotenti. Il tessuto adiposo è composto da adipociti maturi, fasci collagenici, hADASc (cellule staminali adiposo derivate), cellule derivanti dal sangue periferico, cellule vascolari e progenitori endoteliali. Gli adipociti maturi rappresentano circa il 90% della composizione dell’intero tessuto.
Nostri studi, pubblicati su riviste scientifiche internazionali, si sono concentrati sul caratterizzare ed isolare particolari popolazioni staminali presenti nel tessuto adiposo mediante saggi citofluorimetrici ed analisi differenziative. Le analisi sono state effettuate per specifici antigeni di staminalità quali CD34, CD90, CD117, CD105, CD44, CD54. Per valutare, invece, le potenzialità differenziative delle staminali presenti nel tessuto adiposo, si è proceduto alla stimolazione delle stesse in un terreno adipogenico, addizionato con insulina, indometacina ed isobutilmetilxantina.
Questi componenti sono in grado di accelerare notevolmente la conversione delle cellule mesenchimali indifferenziate in cellule adipose. Il differenziamento adipogenico che avveniva già pochi giorni dopo la stimolazione è stato confermato dalla presenza di cellule positive all’Oil Red O (un colorante specifico per i lipidi intracellulari), ma anche attraverso l’espressione di antigeni specifici, rappresentati, in questo caso, dal PPARg e dall’adiponectina esaminati attraverso uno studio di RT-PCR. Inoltre, le medesime cellule vanno anche incontro ad un incremento di antigeni espressi su cellule endoteliali, quali VEGF, CD44, CD54, CD31, CD133, Flk-1.
Lavorando sulle cellule del tessuto adiposo, i dati ottenuti dalle varie analisi da noi effettuate hanno avvalorato le nostre ipotesi, ossia che tali cellule fossero mesenchimali multipotenti, in grado cioè di espandersi facilmente in vitro e di differenziare in differenti citotipi, se esposte ad un ambiente che esse normalmente non incontrerebbero mai durante il loro percorso differenziativo. In questo modo le cellule rispondono ai segnali provenienti dal nuovo microambiente in cui si trovano, abbandonando il cammino differenziativo già intrapreso e vengono in qualche modo “riprogrammate”, così da differenziare verso un’altra linea cellulare.
Le cellule mesenchimali del tessuto adiposo risultano essere simili a quelle del midollo osseo stesso nel trattamento delle varie patologie dei tessuti e rappresentano pertanto una fonte importante per le terapie cellulari autologhe. Le strategie “rigenerative” basate sulla terapia cellulare come quelle che comprendono l’uso delle cellule staminali, sono di notevole importanza soprattutto perché, come nel nostro caso, la possibilità di ottenere un adipe differenziato impedisce la proliferazione incontrollata e l’aver ottenuto simultaneamente vasi sanguigni, impedisce la necrosi che è un effetto collaterale gravissimo che sinora ha fatto fallire tutti i tentativi di autoimpianto di adipe autologo e rappresentano l’ideale risorsa di cellule per la medicina rigenerativa.
La medicina rigenerativa utilizza le materie prime del corpo per la riparazione di cellule, matrice e/o componenti chimici per ripristinarne la naturale funzione. Le cellule staminali hanno richiamato l’attenzione soprattutto per la loro multipotenzialità e per la loro capacità a rigenerare (self-renewal); infatti le cellule staminali del midollo osseo, così come quelle del sangue periferico e del cordone ombelicale sono state utilizzate per una serie di patologie. Inoltre i problemi associati al trapianto allogenico come le risposte immunitarie dell’ospite ed il rigetto del trapianto, possono essere evitate grazie all’uso delle staminali autologhe. Quindi, le cellule staminali autologhe, come quelle derivate dal midollo osseo e dal tessuto adiposo, possono essere utilizzate clinicamente nella terapia “rigenerativa” e “ricostruttiva” se ottenute in quantità sufficienti.
Le cellule staminali in generale ed in particolare quelle adiposo derivate, costituiscono un reagente biologico di straordinaria importanza per la biomedicina e molteplici sono le aree della ricerca ove possono essere impiegate. Alcune tra le più promettenti sono quelle legate a: studio di proprietà farmacologiche di nuove molecole e tossicità di nuovi farmaci; organi artificiali (rene, fegato, cuore, denti, vasi); nuovi vettori utili per terapie geniche - per esempio le cellule staminali possono essere impiegate per il trasferimento di geni nelle terapie antitumorali o come “proiettili” contro particolari tipi di cellule cancerose; fattori responsabili per la attrazione delle staminali nel sito tissutale danneggiato ed ingegnerizzazione genetica al fine di evitare la reazione immunitaria.
Risultati dei nostri studi sono incoraggianti in quanto le staminali adiposo derivate rappresentano l’ideale risorsa di cellule per la medicina rigenerativa. In primo luogo, per la loro multipotenzialità ed in secondo luogo per avere una potenzialità significativa nell’angiogenesi e nella vasculogenesi, una delle limitazioni fondamentali della tecnica corrente di utilizzo del grasso autologo, con una netta ottimizzazione delle zone danneggiate da parte delle cellule staminali, successivo rilascio di fattori angiogenetici e formazione di nuovi vasi.
Questo processo favorirebbe lo sviluppo delle cellule staminali in adipociti maturi e in una nuova microcircolazione che andrebbe a sostituire il tessuto precedentemente danneggiato. Il nostro attuale obiettivo consiste nella ricerca di uno “scaffold”, cioè una impalcatura di sostegno per le cellule staminali da noi prodotte, utilizzando materiali riassorbibili come PLGA - poly (lactic-co-glycolic acid) - oppure l’utilizzo di spugne di acido ialuronico o matrici di collageno ovvero fibrina, per realizzare in laboratorio il tessuto nella sua interezza ed ampliarne le possibilità di impiego a fini ricostruttivi.